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Resumen 

En los últimos años, México ha enfrentado una gran problemática debido a la cantidad de cuerpos que se encuentran sin identificar, lo cual ha sobrepasado la capacidad por parte de las instituciones encargadas de dicha tarea. La genética forense, para poder llevar a cabo las identificaciones,  emplea sistemas de  identificación humana basados en STRs autosómicos. Sin embargo, las condiciones de la muestra que se analiza en estos casos no siempre son  óptimas para este tipo de estudios, por lo que se requieren del uso de otro tipo de marcadores, como el ADN mitocondrial (ADNmt). Este marcador no se utiliza de forma rutinaria en los laboratorios de genética forense, ya que es laborioso y requiere de una capacitación especializada. En el presente artículo, se hace una revisión acerca del análisis del polimorfismo del ADNmt para la identificación forense.    

Palabras clave: ADNmt, identificación, región control, polimorfismos, secuenciación. 

Abstract 

In recent years, Mexico has faced a big problem due the number of bodies without identification, which has exceeded the capacity of the public institutions in charge to perform this task. To perform identifications, forensic genetics employs human identification systems based in autosomal STRs profiles. However, the sample conditions in these cases are not optimum, thus it is required additional genetic markers, such as mitochondrial DNA (mtDNA). This genetic marker is not commonly used in the forensic genetic laboratories, since it is laborious and requires qualified personnel. In the present paper, we review about the mtDNA polymorphism analysis for forensic human identification.  

Keywords: mtDNA, identification, control region, polymorphisms, sequencing. 

Antecedentes

Crisis forense 

En México, del año 2018 al 2020, hubo un reporte de 1,257 fosas encontradas en distintas entidades federativas de donde exhumaron 1,957 cuerpos, de los cuales solo 806 han sido identificados (1). Estos cuerpos sin identificar se suman a los 38,713 que se han reportado como no identificados desde el año 2006 (2). Más aún, en los últimos 13 años, la capacidad de los Servicios Médico Forenses y de Servicios Periciales del país se ha visto rebasada, orillando al gobierno a reconocer esta situación como una crisis de índole forense. Gran parte de los cuerpos que se han podido identificar, ha sido empleando sistemas de identificación humana basados en STRs autosómicos. No obstante, existen casos en los que el material biológico puede encontrarse deteriorado, degradado, en pequeñas cantidades, o dañado intencionalmente por agentes físicos o químicos. En estos casos, el último recurso disponible para hacer la identificación es analizando el polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) (3). 

ADN mitocondrial 

El ADN mitocondrial (ADNmt) es un genoma extranuclear que se encuentra en la parte interna de las mitocondrias y ha sido útil para la identificación humana debido a su alta tasa de mutación, la falta de recombinación y la vía de herencia materna (4). Debido a su localización, el ADNmt puede extraerse de diente, cabello sin raíz y hueso, además de presentar un elevado número de copias en comparación con el ADN nuclear (5). El ADNmt se compone de dos regiones, una región codificante que comprende 37 genes relacionados con la cadena respiratoria, y una región no codificante de 1,122 pb conocida como “D-loop” o “región control”, que es una región altamente polimórfica, y en donde se encuentran las regiones hipervariables I y II (HVR I y HVR II). Estas regiones hipervariables, son las que comúnmente se analizan con fines de identificación humana. En la región D-loop también se encuentra una tercera región hipervariable (HVR III), que podría analizarse en aquellos casos en donde se requiera tener un mayor poder de discriminación en comparación con el análisis de las regiones HVR I y HVR II (Figura 1) (6). 

 

 

Figura 1. Representación gráfica del ADN mitocondrial. En esta figura se muestra la región codificante que contiene a los 37 genes mitocondriales, y la región del control del ADN mitocondrial (ADNmt). Dentro de la región de control se encuentran las regiones hipervariables I, II, y III. Los números indican la posición de inicio y término de cada región hipervariable. 

Análisis del ADN mitocondrial en la práctica forense 

Para poder analizar el polimorfismo mitocondrial en la región D-loop se hace una extracción de ADN, seguida de la amplificación de la región control empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction), y la secuenciación de tipo Sanger. Las ventajas de analizar el ADNmt es que no requiere del aislamiento de las mitocondrias para obtener el material genético, en virtud de que puede amplificarse a partir del ADN genómico que se extraiga del tejido, empleando la PCR convencional o en punto final. Dependiendo del caso, se puede amplificar la región de control, o cada región hipervariable por separado, lo cual depende del nivel de degradación del ADN o de las condiciones a las que haya estado expuesta la muestra. Posteriormente, con la secuenciación de Sanger, es posible conocer el orden de los cuatro nucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) presentes en las regiones amplificadas. Las secuencias obtenidas de estas regiones son comparadas con una secuencia de referencia, conocida como secuencia revisada de Cambridge, para identificar los cambios de nucléotidos que ocurren respecto a esta. Cada variación de un solo nucleótido en cada secuencia es reportada y el conjunto de estas determinan un haplotipo mitocondrial (Ej. 16111T, 16223T, 16290T, 16319A, 73G, 146C, 152C, 153G, 195C, 235G, 263G, 309.1C, 315.1C) (7, 8). En cada haplotipo se indica la posición de la variación y el tipo de variación respecto a la secuencia de referencia. Además de identificar el haplotipo mitocondrial, se pueden localizar algunas posiciones, cuyos cambios son más frecuentes en algunas poblaciones. Con el conocimiento de estas variaciones, se pueden identificar los haplogrupos mitocondriales, cuyas frecuencias varían dependiendo de la población analizada. Por ejemplo, en México predominan en más del 90% lo haplogrupos amerindios A, B, C y D, lo que refleja la historia del mestizaje en nuestro país (9). 

La identificación de personas analizando el polimorfismo mitocondrial se realiza comparando los haplotipos mitocondriales obtenidos de la muestra de referencia y la muestra problema. Las muestras problema generalmente son muestras antiguas con un alto nivel de deterioro, como son: osamentas o dientes de individuos encontrados en fosas clandestinas. Debido a que el ADNmt se hereda por vía materna, se deben seleccionar como muestras de referencia, aquellos familiares que compartan el mismo linaje materno con la muestra problema, como puede ser la madre, hermanos, tíos maternos o la abuela materna. Con esta comparación existen tres escenarios posibles: que ambos haplotipos no coincidan, por lo que el resultado es excluyente; que la calidad de la secuencia problema sea mala, por lo que el resultado es no concluyente; y en un tercer caso, que los dos haplotipos coincidan, aunque esto no indica que el individuo al que pertenece la muestra problema está relacionado biológicamente con quien proporcionó la muestra de referencia, sino que más bien comparten el mismo linaje mitocondrial. Al igual que con los STRs autosómicos, se requiere hacer un análisis probabilístico que nos indique qué tantas veces es más probable que esa muestra problema esté relacionada biológicamente con la muestra de referencia, respecto con otro individuo al azar.  

Es importante mencionar que, los cálculos de probabilidad de coincidencia al azar y de razón de verosimilitud en el análisis del polimorfismo del ADNmt requieren de una base de datos que contenga el polimorfismo de las regiones hipervariables I y II de un gran número de individuos, y que sea de la región geográfica de donde provienen las muestras a analizar. El genoma mitocondrial tiene un poder de discriminación bajo, que se ve reflejado en los valores calculados de razón de verosimilitud para este marcador, siendo varias órdenes de magnitud por debajo de los calculados para el análisis con STRs autosómicos (ej. 150 vs. 1 x 10 15). Una forma de incrementar estas razones de verosimilitudes es generando bases de datos poblacionales del polimorfismo mitocondrial robustas (n>1000 individuos), debido a que dichos cálculos dependen directamente del número de individuos incluidos en estas bases de datos. (3, 5, 10-14). El análisis del ADNmt no se lleva a cabo en los laboratorios de genética forense de forma rutinaria, pues es un proceso que conlleva más tiempo en comparación con el análisis de STRs, es laborioso y sujeto a error, además de que se requiere de amplia experiencia por parte del personal de laboratorio que lo lleva a cabo para identificar las heteroplasmias, por ejemplo. Sin embargo, a pesar de lo laborioso de este procedimiento y del bajo poder de discriminación de este marcador genético, en ocasiones es el único recurso con el que se cuenta para poder llevar a cabo una identificación humana. 

Uso de ADN mitocondrial en México  

En México existen pocos laboratorios de genética forense que analizan el polimorfismo del ADNmt con fines de identificación humana. No obstante, se han hecho en el país diversos estudios del polimorfismo del ADNmt, los cuales se han enfocado en el estudio de la diversidad genética en la población mexicana, y el análisis de restos óseos antiguos (9, 15, 16). Aunque estos estudios no están enfocados en la aplicación del polimorfismo mitocondrial en el campo forense, los datos generados de estos estudios han sido utilizados como bases de datos poblacionales para la identificación humana empleando este marcador (17). A pesar de que en el país es reconocida la importancia de este marcador como herramienta en la cuestión forense (18), existen pocos casos conocidos en donde haya empleado. Uno de los más conocidos fue el caso de la desaparición de los 43 estudiantes normalistas de Iguala, Guerrero en donde se pudo analizar satisfactoriamente el polimorfismo mitocondrial en al menos dos restos óseos empleando secuenciación de última generación (19-21). Sin embargo, es importante mencionar que, para este caso, la muestra en la que solo se pudo analizar con el polimorfismo mitocondrial, se concluyó que fue una identificación de moderada significancia (22). 

Perspectivas 

Debido a la crisis forense por la que está atravesando México, es probable que en muchos casos se tenga que recurrir al análisis de este marcador, por lo que existe la necesidad de desarrollo de protocolos y lineamientos, así como el fortalecimiento en la capacitación para su realización. Además, se requieren generar bases de datos mitocondriales de población mexicana, que cumplan los criterios de EMPOP, que puedan ser utilizadas como referencia en el proceso de la identificación humana. Estas bases de datos deben de incluir, además de las regiones hipervariables I y II, la región hipervariable III, lo cual incrementaría el poder de discriminación de este marcador. Por otro lado, con el desarrollo de la secuenciación de última generación, se podrán obtener secuencias en muestras degradadas, por lo que su uso será cada vez más frecuente en el ámbito forense. Con estas tecnologías se podría incrementar el poder de discriminación de este marcador al ser más fácil la secuenciación de todo el genoma mitocondrial, lo cual también implicaría la necesidad de crear bases de datos poblacionales que contengan el polimorfismo de este genoma.   

Conclusiones

La crisis forense que vive México al día de hoy ha llevado a necesitar cada vez más métodos y técnicas nuevas que permitan subsanar las limitaciones con las que se encuentran las instituciones encargadas de la identificación. El análisis de ADNmt ha sido propuesto como una herramienta útil, sumando otra alternativa a todo el abanico de opciones con las que la ciencia forense cuenta para conocer la identidad de una persona.  

Glosario

EMPOP: del inglés EDNAP mtDNA Population Database, es un sitio web que alberga bases de datos generadas a partir del análisis de ADN mitocondrial. 

Haplotipo: conjunto de variaciones de ADN a lo largo de un cromosoma que tienden a ser heredados juntosdebido a que no suele haber cruzamientos o recombinaciones entre estos. 

Haplogrupo: Conjunto de haplotipos. 

Heteroplasmia: es una mezcla de ADN mitocondrial con y sin mutaciones 

Marcador genético: segmento de ADN con una ubicación conocida y cuya herencia se puede rastrear.  

Mitocondria: organelo celular que genera la mayor parte de la energía química necesaria para activar las reacciones bioquímicas de la célula.  

Polimorfismo: variación en la secuencia del genoma presente en al menos el 1% de la población analizada. 

Razón de verosimilitud: en el área de la genética forense, se refiere al cociente entre la probabilidad de que el material genético obtenido de un indicio recolectado provenga de la persona de interés (víctima/probable responsable) llamada “hipótesis de la fiscalía”; entre la probabilidad de que el material genético no provenga de la persona de interés, sino de una persona seleccionada al azar, llamada “hipótesis de la defensa” (RV=Hfiscalía/Hdefensa). 

Recombinación: unión de información genética paterna y materna, que resulta en nuevas moléculas de ADN con una secuencia de nucleótidos distinta. 

Secuenciación: determinación del orden en el que se encuentran  las bases nitrogenadas (adenina, citosina, timina y guanina) del ADN. 

STR: del inglés Short Tandem Repeat, son secuencias cortas y repetitivas del ADN utilizados como marcadores genéticos. 

Referencias

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  2. Tzuc, E, Turati, M. Un País Rebasado por sus Muertos. [Internet]. 5°ELEMENTO; 2020. [Consultado 02 Feb 2021]. Disponible en: https://quintoelab.org/crisisforense/un-pais-rebasado-por-sus-muertos/ 
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Crédito de imagen: iStock.com/wir0man

Lic. Samantha Vázquez Corona. Concluyó sus estudios en la Licenciatura en Ciencia Forense por parte de la Universidad Nacional Autónoma de México, en donde es tesista con el proyecto “Elaboración de un protocolo para el análisis del polimorfismo de las Regiones Hipervariables I, II y III de la Región de Control del ADN mitocondrial para la identificación forense”, bajo la asesoría del Dr. Mariano Guardado Estrada.  Actualmente, colabora con la Unidad de Análisis de Contexto de la Comisión Nacional de Búsqueda de Personas, como prestadora de servicio social.

Dr. Mariano Guardado Estrada. Doctor en Ciencias por parte de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y Médico Cirujano por parte de la Universidad Autónoma de Guadalajara (UAG). Es Profesor de Tiempo completo en la Licenciatura en Ciencia Forense de la UNAM e imparte las asignaturas de “Biología Molecular y Genética” y “Ciencias Morfofuncionales. Es Nivel I en el Sistema Nacional de Investigadores (SNI) desde el 2015. Ha participado en investigaciones relacionadas con la genómica, genética forense, genética de poblaciones, polimorfismo mitocondrial, diagnóstico molecular y bioinformática. Cuenta con diversas publicaciones científicas nacionales e internacionales, así como capítulos de libro. Correo electrónico: mguardado@cienciaforense.facmed.unam.mx